Мяндина Г.И., Тарасенко Е.В. Медицинская паразитология. Г. И. Мяндина Е. В. Тарасенко

Методы микроскопических исследований Г ЛАВАМ Е ТО ДЫМИ КР ОС КОПИ ЧЕСКИ ХИ С СЛЕДОВАНИЙ bМикроскопияb (греч. mikros — маленький и skopeo — вижу) — изучение объектов с использованием микроскопа. Микроскопия служит одним из основных методов исследований в биологии и медицине. Развитие и усовершенствование микроскопических методов исследования и микроскопической техники тесно связаны с возможностью изучения клеток и клеточных структур. В зависимости от целей исследования применяют различные методы микроскопии световую, фазово-контрастную, электронную. Наиболее распространенный метод исследований клеток — световая микроскопия. Оптический, или световой, микроскоп использует видимый свет, проходящий через прозрачные объекты или отраженный от непрозрачных объектов. Оптическая система микроскопа состоит из нескольких линз и позволяет получить кажущееся увеличенное изображение образца. Полученное изображение можно наблюдать одним глазом (или двумя глазами в бинокуляре), фотографировать, передавать на видеокамеру для оцифровки. УСТРОЙСТВО МИКРОСКОПА
Световой микроскоп увеличивает рассматриваемый объект враз. Он дает обратное (перевернутое, увеличенное и мнимое изображение. Микроскоп состоит из механической, осветительной и оптической систем. Механическая система микроскопа включает основание микроскопа, тубус, тубусодержатель, монокулярную насадку, вращающийся револьвер с отверстиями для объективов, макровинт (кремальера, микровинт, предметный столик с пружинными клеммами, винт управления конденсором и кронштейн конденсора. Тубус микроскопа перемещается при вращении макровинта — рукоятки грубой фокусировки.
Осветительная система предназначена для направления световых лучей на изучаемый объект. Она включает зеркало, диафрагму, конденсор и съемный светофильтр. В оптическую систему входят объективы, окуляр и откидная линза.
Устройство микроскопа изображено на рис. 1, 2.

МЕДИЦИНСКАЯ ПАРАЗИТОЛОГИЯ bРис. 1. Микроскоп МБР-1:
1 — основание 2 — микровинт; 3 — макровинт; 4 — винты для перемещения предметного столика
5 — предметный столик 6 — тубусодержатель; 7 — окуляр 8 — тубус 9 — револьвер 10 — объективы 11 — отверстие предметного столика 12 — конденсор 13 — диафрагма 14 — винт конденсора
15 — зеркало 4
1 3
2 10 11 14 15 13 12 5
8 7

Методы микроскопических исследований bРис. 2. Микроскоп МБС-1 (стереоскопический — предметный столик 2 — винт для наводки на фокус 3 — устройство для переключения степени увеличения 4 — штатив 5 — окуляр 6 — бинокулярная насадка 7 — оптическая головка 8 — объектив 9 — зеркало 8
9 6
5 2
3 1
4

МЕДИЦИНСКАЯ ПАРАЗИТОЛОГИЯ. МЕТОДЫ МИКРОСКОПИИ
Основными характеристиками любого микроскопа являются разрешающая способность и контраст. Качество изображения, его четкость, определяется разрешающей способностью микроскопа, те. возможностью различать раздельно две близко расположенные точки. Разрешающая способность — это минимальное расстояние, на котором находятся две точки, демонстрируемые микроскопом раздельно. Разрешение человеческого глаза в режиме наилучшего видения равно 0,2 мм. Для обычного светового микроскопа разрешаемое расстояние равно приблизительно 0,2 мкм. Контраст изображения — это различие яркостей изображения и фона. На контраст влияют как свойства объекта, которые изменяют световой поток по сравнению с фоном, таки способности оптики уловить возникающие различия в свойствах луча. Возможности светового микроскопа ограничены волновой природой света. Физические свойства света — цвет (длина волны, яркость (амплитуда волны, фаза, плотность и направление распространения волны изменяются в зависимости от свойств объекта. Эти различия и используются в современных микроскопах для создания контраста. Увеличение микроскопа определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра. У типичных исследовательских микроскопов увеличение окуляра равно 10, а увеличение объективов — 10, 45 и 100. Соответственно, увеличение такого микроскопа составляет от 100 до 1000. Некоторые из световых микроскопов имеют увеличение до 2000. При более высоком увеличении качество изображения ухудшается. Числовая апертура используется для выражения разрешающей способности оптической системы или светосилы объектива. Светосила объектива — интенсивность света, приходящаяся на единицу площади изображения, приблизительно равна квадрату NA. Величина NA составляет примерно 0,95 для хорошего объектива. Микроскоп обычно рассчитывают таким образом, чтобы его полное увеличение составляло около 1000 NA. Если между объективом и образцом ввести жидкость (масло или, что бывает реже, дистиллированную воду, то получится иммерсионный объектив с величиной NA, достигающей
1,4, и с соответствующим улучшением разрешения. Основную роль в получении изображения играет объектив Он строит увеличенное, действительное и перевернутое изображение объекта. Затем это изображение дополнительно увеличивается при рассматривании его через окуляр, который дает увеличенное мнимое изображение. В зависимости от среды, которая находится между объективом и препаратом, различают сухие объективы малого и среднего увеличения (дои иммерсионные с максимальной апертурой и увеличением (90–100
). Особенностью иммерсионных объективов является то, что между фронтальной линзой такого объектива и препаратом помещают иммерсионную жидкость, имеющую показатель преломления такой же, как стекло, что обеспечивает увеличение числовой апертуры и разрешающей способности объектива. В качестве иммерсионной жидкости для объективов водной иммерсии используют дистиллированную воду, а для объективов масляной иммерсии — кедровое масло или специальное синтетическое иммерсионное масло. Использование синтетического иммерсионного масла предпоч-

Методы микроскопических исследований тительнее, поскольку его параметры более точно нормируются, ионов отличие от кедрового, не засыхает на поверхности фронтальной линзы объектива.
Все характеристики объектива обозначены на его оправе собственное увеличение, апертура, тип объектива (например, АПО — апохромат объективы водной иммерсии имеют обозначение ВИ и белое кольцо вокруг оправы в нижней ее части, объективы масляной иммерсии — обозначение МИ и черное кольцо. Все объективы рассчитаны для работы с покровным стеклом толщиной мм. Толщина покровного стекла особенно влияет на качество изображения при работе с сильными сухими системами (40
) и с иммерсионными объективами нельзя пользоваться покровными стеклами толще 0,17 мм.
Окуляры состоят из двух линз и тоже бывают нескольких типов, каждый из которых применяется с определенным типом объектива, дополнительно устраняя недостатки изображения. Характеристики окуляра обозначены на его оправе.
Помимо световой микроскопии, существуют фазово-контрастная, люминесцентная, поляризационная, ультрафиолетовая и электронная микроскопия. В основе этих методов лежат различные свойства света. При электронной микроскопии изображение объектов исследования возникает за счет направленного потока электронов.
Электронная микроскопия может быть трансмиссионной, когда пучок электронов проходит сквозь изучаемый ультратонкий срез, или же растровой, или сканирующей, когда пучок электронов отражается от поверхности исследуемого объекта. В первом случае электронный микроскоп называется трансмиссионным (ТЭМ), а во втором — сканирующим (СЭМ. С помощью просвечивающего (трансмиссионного) электронного микроскопа можно получить плоскостное изображение изучаемого объекта. Для получения пространственного представления о структурах используют сканирующие электронные микроскопы, способные создавать трехмерные изображения. Главными достоинствами электронной микроскопии являются большая глубина резкости (враз больше, чему световых микроскопов, широкий диапазон непрерывного изменения увеличения (от десятков до десятков тысяч рази высокая разрешающая способность